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肝癌细胞系的培养方法!

小杨 / 2019-09-24

正文


肝癌细胞系的培养方法

一、材料与方法

⒈材料

DMEM高糖、RPMI-1640培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司; Anti-Human Thy-1(CD90) FITC、Mouse lgG1 K Isotype Control FITC、Anti-Human EpCAM PE和MouselgG1 K Isotype Control购自eBioscience公司; 五种肝癌细胞系(HepG2、SMMC-7721、Bel-7404、Bel-7403和Sk-Hep-1)均购自中科院上海生命科学研究院细胞库,并由广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部保存提供; CCK-8试剂购自上海生博医学生物工程科技有限公司; 流式细胞仪(美国BD公司)。

肝癌细胞系的培养

肝癌细胞系HepG2用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培养基培养。其余四种肝癌细胞系(SMMC-7721、Bel-7404、Bel-7403及Sk-Hep-1)用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。细胞在37 °C、5%CO2的培养箱中孵育, 待细胞进入对数生长期后进行传代培养, 细胞的传代和收集用0.25%胰蛋白酶消化贴壁生长细胞。PBS洗涤细胞, 然后用 500 μL 2%胎牛血清的PBS重悬细胞, 上机分析。

流式细胞仪检测分析

取对数生长期生长状态良好的肝癌细胞, 0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液, 计数并调整细胞数量约107数量级; 用含2%胎牛血清的PBS洗涤、离心、重悬细胞为单细胞悬液。分别加入相应流式抗体(CD90-FITC, FITC同型对照; EpCAM-PE, PE同型对照)5 μL, 并加入95 μL含2%胎牛血清的PBS至总体积为100 μL, 室温避光孵育30 min, 并设立阴性对照。

⒋CCK-8法检测细胞体外增殖能力

将分选的EpCAM+细胞、EpCAM–细胞和未分选的Bel-7404细胞调整密度至1×104/mL, 接种至96孔板, 每孔200μL, 置于37 °C、5% CO2细胞培养箱中培养, 隔日换液。在接种后的第1, 3, 5, 7 d随机取出一块96孔板, 每孔加入CCK-8试剂20 μL, 细胞培养箱中孵育1 h后在酶标仪上450 nm波长处检测吸光度(D)值。以生长天数为横坐标, 吸光度为纵坐标,绘制三组细胞的生长曲线。

⒌耐药能力的比较

将分选的EpCAM+细胞、EpCAM–细胞和未分选的Bel-7404细胞调整密度至1.25×104 /mL, 以200 μL/孔接种至96孔板, 三组细胞都设置对照组和加药组。

培养24 h后, 每种细胞加药组加入12 μmol/L的顺铂。隔天更换相应的培养基, 继续培养72 h后, 取出96孔板, 每孔加入20 μL CCK-8试剂, 培养箱中孵育1 h,酶标仪检测各孔内细胞在450 nm处的吸光度(D)值。

计算抑制率: 抑制率(%)=(D0–Dm)/D0 ×100%。Dm和D0 分别为加药组和对照组的D450值。

⒍平板克隆实验

将分选的EpCAM + 细胞、EpCAM–细胞和未分选的Bel-7404细胞调整密度至1×104 /mL, 接种细胞到6孔板, 每孔1000个细胞。6孔板置于37 °C、5%CO2培养箱中培养。15 d后, 弃掉培养液, 进行Gi-emsa染色, 计数 ≥ 50个细胞的克隆数。克隆形成率=形成的克隆数/接种细胞数×100%。

⒎统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件进行数据处理。计量资料的比较用t检验, 计数资料的比较用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

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